化脓及创伤感染标本细菌学检验知识

　　脓液及创伤分泌物是传染过程中最常见的，对其标本的采集和送检，检验人员与执业医师网临床医师应密切配合，以确保正确的采集和快速送检。从脓液及创伤分泌物中能够检出的细菌种类很多，最优先考虑的致病菌为金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌，其次为假单胞菌、肠杆菌科细菌等。下面是小编为大家带来的化脓及创伤感染标本细菌学检验知识，欢迎阅读。

　　知识1：

　　一、脓液及创伤感染标本中可能发现的细菌

　　在临床化脓及创伤感染标本的细菌学检验中可能发现的细菌：

　　1.革兰阳性球菌

　　葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、四联球菌。

　　2.革兰阴性球菌

　　卡他布兰汉菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、干燥球菌、黄色球菌。

　　3.革兰阳性杆菌

　　破伤风芽胞梭菌、炭疽芽胞杆菌、产气荚膜芽胞梭菌、白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌、结核分枝杆菌。

　　4.革兰阴性杆菌

　　大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、产气肠杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉热弗朗西斯菌、肺炎克雷伯菌、厌氧杆菌。

　　5.其他

　　伊色列放线菌、星形奴卡菌、白色假丝酵母菌。

　　二、标本的采集

　　(一)操作

　　1.首先用无菌生理盐水拭净病灶表面的污染杂菌。

　　2.对已破溃脓肿一般以无菌棉拭子采取脓液及病灶深部的分泌物，而瘘管则以无菌方法采取组织碎片，放入无菌试管中送检。

　　3.对未破溃脓肿最好用2.5%～3%碘酊和75%酒精消毒患部皮肤后，以无菌注射器抽取脓汁及分泌物，也可于切开排脓时，以无菌棉拭采取。

　　4.有时也可将沾有脓汁的最内层敷料放入无菌平皿内送检。

　　5.对放线菌的标本，常用无菌棉拭挤压瘘管，选取流出脓汁中的“硫磺样颗粒”盛于试管内送检，也可将灭菌纱布塞入瘘管内。次日取出送检。

　　(二)注意事项

　　1.如果患者局部伤口已用抗生素磺胺类药物治疗，则应在培养基内加入相应的物质(如青霉素酶、对氨基苯甲酸等)以避免假阴性结果的出现。

　　2.当创伤出血时或敷有药物在2小时以内及烧伤在12小时内均不应采集标本，此时获得阳性结果的机会甚少。

　　3.标本采取后应及时检查，如不能立即检验应置冰箱内保存，以防杂菌污染。

　　4.采集标本时注意观察脓汁及分泌物的性状，色泽及有无恶臭味等，为培养和鉴定提供参考依据。如脓汁带绿色时，可能有铜绿假单胞菌的感染，有恶臭味时可能有厌氧菌感染。

　　三、检验程序

　　脓液及创伤感染标本的细菌学检验程序参见图

　　化脓及创伤感染标本的检验程序

　　四、检验方法及报告方式

　　(一)直接涂片检查

　　1.一般细菌涂片检查

　　取一洁净玻片，用玻璃笔标明标本号、将待检标本置于玻片上涂成薄膜，经火焰固定后进行革兰染色镜检。根据镜下所见细菌的形态及染色特点，可做初步报告：“找到革兰X性X菌，形似XX菌”。如发现具有芽胞或荚膜的细菌，报告时应注明其大小与位置及疑似XX菌。如镜检时未发现细菌时，可初步报告为：“直接涂片，未找到细菌”。对疑有结核分枝杆菌感染的标本，还应作抗酸染色检查。

　　2.伊色列放线菌及星形奴卡菌涂片检查

　　用肉眼或放大镜检查脓汁、分泌物或敷料内有无直径1mm以下的灰白色或硫磺样颗粒，用接种环挑取含有硫磺样颗粒的标本置于洁净的玻片内，覆以盖玻片，轻轻挤压。若颗粒结构不明显，可加50g～100g/L的氢氧化钾溶液2～3滴加以消化。用低倍镜及高倍镜仔细观察。如有伊色列放线菌的颗粒，可见中央为交织的菌丝，菌丝的末端稍膨大似棒状排列并呈放射状。有时可见嵌于类似明胶的鞘膜内。奴卡菌与伊色列放线菌形态基本上相同，但在分枝菌丝末端一般不膨大成棒状，革兰染色阳性，抗酸染色呈抗酸性;而伊色列放线菌革兰染色阳性，抗酸染色呈蓝色，为非抗酸性。如查见中间部分菌丝染成革兰阳性，向四周放射的末梢部分菌丝呈革兰阴性，抗酸染色为非抗酸性者，可报告：“找到伊色列放线菌”;若革兰染色反应与伊色列放线菌相同，而抗酸染色为抗酸性者，可报告为：“找到奴卡菌。”

　　如革兰染色为阴性，抗酸染色为非抗酸性者，可报告：“未找到伊色列放线菌及星形奴卡菌”。

　　(二)培养检查

　　1.一般细菌培养

　　取脓汁棉拭子或将脓汁用接种环接种于血平板上划线分离，置37℃孵箱培养18～24h，观察结果，如有细菌生长，可按菌落特征挑取各种单独的菌落，分别涂片进行革兰染色镜检。通常根据菌落特点结合涂片结果，多可初步判断出细菌的类属，然后再按各类细菌的生物学性状进行鉴定。菌落小如针尖，周围伴有大而透明的溶血环可能为溶血性链球菌，结合镜检有助于鉴别，必要时进行血清肉汤培养，若出现沉淀生长且涂片染色为长链状排列，即可报告：“培养出乙型溶血性链球菌。”血平板上见中等大小有脂溶性金黄色色素或无特殊色素有透明溶血环，涂片染色为革兰阳性球菌呈葡萄状排列，可进一步作甘露醇发酵试验，血浆凝固酶试验等，如阳性时，可报告：“培养出金黄色葡萄球菌”。如见到菌落与医.学全在线上述近似但无溶血环，血浆凝固酶试验阴性，可初步报告：“培养出血浆凝固酶阴性葡萄球菌”。如见菌落小，周围有草绿色溶血环，染色镜检为革兰阳性球菌，呈短链排列多为甲型溶血性链球菌，呈双排列多为肺炎链球菌。确定诊断则需进一步作鉴定试验和鉴别试验。如有变形杆菌生长而影响其他细菌分离，可将标本接种于含有4g/L硼酸的血平板上，以抑制变形杆菌生长，再进行分离培养、鉴定。根据鉴定结果及菌落的多少，即可报告：“培养出XX菌”。如观察48小时后，无细菌生长，可报告：“培养48小时后，无细菌生长”。若遇到难以鉴定的细菌时，应详细描述革兰染色性质、菌体以及菌落的形态特点、生化反应、血清学试验结果等，必要时做G+C摩尔百分比浓度测定、动物试验观察其致病力，以供临床医师参考。

　　2.炭疽芽胞杆菌培养

　　疑为炭疽芽胞杆菌感染时，可取患部脓液接种于血平板，对于污染严重的标本，可首先在肉汤培养基内增菌一夜后，经80℃20分钟加热，杀灭非芽胞细菌，然后再移种血平板作分离培养，经37℃18～24h培养后，如在血平板上见有大而扁平、毛茸状、灰白色、边缘不整齐，形似卷发状(以低倍镜下观察更为清楚)不溶血的菌落，则挑取菌落涂片染色镜检，如为革兰阳性竹节状大杆菌，排列呈链状，悬滴检查无动力，则可作出初步诊断，必要时再做动物接种以及串珠试验和噬菌体裂解等鉴别试验，并作出结论。

　　3.厌氧菌培养

　　疑为厌氧菌感染的标本，可将标本接种于牛心、牛脑浸出液或布氏菌肉汤培养基中，亦可直接接种KVA血平板(或LKV血平板)，置厌氧环境中培养。分离厌氧芽胞杆菌如破伤风芽胞梭菌及产气荚膜芽胞梭菌时，应将已接种标本的液体培养基先置80℃水浴中加热20分钟杀灭非芽胞细菌，然后经37℃24～48h培养后，根据生长情况及涂片染色镜检结果，按该厌氧菌的生物学性状(生化反应和动物试验)进行鉴定。经最后证实，即可报告：“培养出XX菌”。若经3～5天培养仍未见细菌生长者，即可报告：“厌氧培养X天未见细菌生长”。

　　4.伊色列放线菌及星形奴卡菌培养

　　(1)若疑有杂菌污染的瘘管引流液，应首先将标本倒入无菌平皿内，以无菌蒸馏水洗涤溶解血细胞后，再挑选典型或可疑的硫磺样颗粒，将其压碎，然后分别接种于两份葡萄糖肉汤琼脂平板上置37℃进行需氧及厌氧培养，同时接种沙保弱葡萄糖琼腊斜面(或平板)上，置22℃～28℃培养。如无硫磺样颗粒，也可取标本直接接种于上述培养基。

　　(2)对于未被细菌或真菌污染的标本，可直接采取硫磺样颗粒或脓液接种人硫乙醇酸钠肉汤或深层葡萄糖肉汤琼脂培养基，置37℃进行厌氧培养，同时接种沙保弱葡萄糖琼脂斜面，置22℃～28℃培养。

　　(3)经4天培养后，若在厌氧培养的葡萄糖肉汤琼脂平板上见有白色、粗糙或结节状的菌落生长，粘附于培养基上不易用接种环取下，且在盐水内不易乳化，而在需氧培养的平板上则无类似菌落生长时，可疑为伊色列放线菌切尔西直播入口。

　　(4)将疑为伊色列放线菌的菌落移种于硫乙醇酸钠肉汤管的底部：置37℃培养4～6天后，可见有白色绒毛样菌团物长出，摇动后破碎，上部培养液仍保持澄清。移种于葡萄糖肉汤琼脂作深层培养，经37℃培养4～6天后，可见在深层培养管表面下层出现分叶状的菌落。取菌落作涂片镜检，可见有交织成团或小碎片状菌丝，抗酸染色为非抗酸性菌丝，可报告：“有伊色列放线菌生长”。

　　(5)如有奴卡菌生长，则在需氧培养的沙保弱培养基上出现光滑、不规则折叠或颗粒状的菌落，具有黄色至橙黄色的颜色，取菌落作湿片镜检，如发现精细分枝状菌丝，呈革兰阳性，抗酸性染色呈红色的菌丝者，可报告：“有奴卡菌生长”。

　　(三)抗生素敏感试验提示

　　1.接到标本后，48小时内应得出抗生素敏感试验结果。

　　2.由于链球菌、巴斯德菌和放线菌等几乎都对青霉素敏感，故不必对其测试抗生素敏感性。

　　3.耐苯唑西林的葡萄球菌对头孢菌素亦耐药，耐青霉素的葡萄球菌对氨苄西林亦耐药，不必重复测试。

　　知识2：

　　一、脓液是什么？

　　脓液（pus）是机体局部炎症组织坏死的溶解产物。在炎症过程中,由于局部血液循环严重障碍及病原菌的内、外毒素作用等,可发生局部组织营养不良及变性,最后导致坏死。坏死组织在细菌毒素及死亡的白细胞释放出的蛋白酶作用下,水解化为肉眼呈灰黄色或黄白色的浓稠状液体。一个白细胞处理5～25个病菌后就会死亡，死亡的白细胞体和细菌分解产物构成脓液。因此脓液中主要由组织分解产物、炎症渗出物、白细胞及死亡的细菌等组成。

　　二、微生物生长需要的条件？人工培养细菌需要提供充足的营养物质如：水、碳源、氮源、无机盐等，使细菌获得生长繁殖所需要的原料和能量。除此之外尚要有适宜的环境条件，如酸碱度、渗透压、温度和必要的气体等，多数细菌在代谢过程中需要CO2，但分解糖类时产生的CO2已足够其所需，且空气中还有微量CO2，不必额外补充，只有少数菌如布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等必须在5%-10%CO2环境中才能生长。

　　三、如何采集脓液和创伤分泌物标本才能满足细菌培养要求呢？检验项目：脓汁和创面分泌物的一般细菌涂片、真菌涂片、结核菌涂片、细菌培养及鉴定。标本采集方法：

　　1、局部组织或器官有化脓性感染表现任何标本进行细菌培养实验室建议在抗菌药物使用前进行采样；采样前可用无菌生理盐水清洗病灶表面的污染杂菌，采集后立即送检。

　　2、对已破溃开放性脓肿用无菌生理盐水或75%酒精擦去表面渗出物，用无菌拭子深入溃疡基底部或边缘部取，注意尽量取化脓组织与正常组织交界处的脓汁，因为脓汁中心的细菌大部分已死亡，交界处的活菌较多，会提高阳性率。需取两个拭子置无菌管中送检，分别做细菌涂片和培养检查。

　　3、封闭性脓肿：一般采用穿刺或手术引流的方法采取。采集前用75%酒精消毒脓肿局部皮肤或黏膜表面后，用无菌注射器穿刺抽取脓液5-10ml，置无菌管中送检；也可切开排脓用无菌棉拭子采取深部的分泌物送检。

　　4、对瘘管的标本，常用无菌棉拭子挤压，选取脓汁中“硫磺样颗粒”，置于无菌管中送检。

　　5、如有恶臭等怀疑厌氧菌感染时，标本采集后应在30分钟内送检。硫磺样颗粒：在患者病灶组织和瘘管中流出的脓汁中，肉眼可见的由放线菌在组织中形成的黄色小颗粒状菌落。

　　6、烧伤伤口：先清创，出现渗出物后用拭子用力采集病灶基底部或边缘的标本。也可送组织标本。

　　7、脓疱或水疱：用酒精进行表面消毒，待消毒液干燥，用针头（小儿用23号针头）挑破脓疱，用拭子采集脓疱液和基底部标本。

　　三、注意事项：

　　①采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂，应在用药之前采取。

　　②对大多数开放伤口，采集前应先清创，去除表面菌群。

　　③除非有渗出物，干燥、结痂伤口取材一般不做培养。

　　④闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本，不能用拭子采集。开放脓肿处理同开放伤口。

　　⑤不要仅仅送检脓液，应在病灶活动区域或基底部采集标本，最好是组织标本。

　　四、标本送检与保存

　　1、送检地点：南大港医院二楼检验科。

　　2、标本采集后应尽快送检，如果在1h内不能及时送检可保存在4℃冰箱中，但保存时间不超过24h。

　　3、怀疑淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和厌氧菌感染需常温立即送检；禁止冷藏。

　　如果没能及时送检，放常温超过1小时，细菌快速生老病死失去了诊断价值；放到4℃冰箱，淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌又会被冻死；因此一个合格的微生物检验标本对检验前的各个环节，无论是采集指证、严格的无菌采集、标本送检及保存等过程实施有效的检验前质量控制是提高病原微生物检出率，保障医疗质量，有效指导临床用药的基本前提和先决条件。

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